Головна Біологія Вісник Дніпропетровського університету АВЕРМЕКТИНЫ – БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА СТРЕПТОМИЦЕТОВ
joomla
АВЕРМЕКТИНЫ – БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА СТРЕПТОМИЦЕТОВ
Біологія - Вісник Дніпропетровського університету

И. А. Евтушенко, И. Е. Соколова11 Днепропетровский национальный университет

Проаналізовано літературні відомості Про авермектини – Біологічно активні речовини стрептоміцетів. Охарактеризовано склад І властивості авермектинів. Описані оптимальні умови Культивування продуцентів, методи визначення Та Екстракції Авермектинового комплексу. Наве-Дені приклади Перспективного Застосування авермектинів У Ветеринарії Та Медицині.

The survey includes analysis of literature data on avermectins – biological active substances of streptomycetes. Its structure and properties, optimal conditions of cultivation, methods of avermectin-complex determination and extraction are described. Examples of perspective application of avermectins In veterinary and medicine are presented.

Введение

Значительная часть стрептомицетов является продуцентами биологически актив-ных веществ, таких как антибиотики, витамины, ферменты, иммуномодуляторы и др. Стрептомицеты представляют большой интерес в связи с их значением для промышлен-ного приготовления разных антибиотиков и ряда биологически активных веществ. Осо-бое значение в последнее время приобрели поликетидные соединения, которые успешно используются в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве как антибактериальные, противоопухолевые и антигельминтные препараты. Недавно стало известно о способно-сти почвенных стрептомицетов синтезировать новый класс веществ под общим названи-ем авермектины, которые действуют не только подобно поликетидным антибиотикам, но и имеют более широкий спектр биологического действия [4].

Классификация авермектинов

В настоящее время авермектины, продукты жизнедеятельности S. Avermitilis, признаны самым эффективным средством борьбы с эндо - и эктопаразитами расте-ний, животных и человека. Авермектины принадлежат к классу 16-членных макро-лидов, которые в положении С13 Имеют дисахарид, состоящий из L-олеандрозы (2,6-дидезокси-3-О-метил-L-арабиногексозы). Культура продуцента синтезирует ком-плекс из восьми авермектинов, среди которых выделяют четыре мажорных (А, А2а, В1а, В2а) и четыре минорных (А1B, A2B, В1B, В2B) компонентов [3]. Известна также полу-синтетическая форма авермектинов – ивермектин, который представляет собой смесь, состоящую из авермектинов ВИ В1B, подвергнутых гидрогенизации в поло-жении 22 и 23. Авермектины группы В Обладают инсектицидным, аскарицидным и нематодоцидным действием, а группы А – противоопухолевым, особенно авермектин А1, который оказывает цитотоксическое действие на клетки опухолей. Главным пре-имуществом антипаразитарных препаратов, созданных на основе авермектинов, яв-ляется отсутствие негативного влияния на организм теплокровных животных. Про-никая в организм паразита через кишечник или контактным путем, авермектины влияют на его нервную систему и вызывают паралич, а потом гибель. Препараты авермектинов широко применяются в ветеринарии и растениеводстве. В почве пре-параты инактивируются за 7–14 суток [4].

Для авермектинового комплекса характерны структурные модификации в трех позициях: С5, С22–23 И С26. Авермектины фракций A И B Различаются тем, что старто-

11© И. А. Евтушенко, И. Е. Соколова, 2006 58


Вой единицей при биосинтезе агликона авермектинов А Является 2-метилбутират, а авермектинов B - Изобутират. При дальнейшей сборке макроцикла в позиции С22-23 Или совершается гидратация (авермектины фракции 1: В1а И В1b), Или нет (авермек-тины фракции 2: В2а, В2b). Предполагается, что эта реакция катализируется дегидра-тазой, кодируемой геном Ave C. Мутация этого гена ведет к образованию только компонентов фракции 2. По окончании процесса образования агликона происходит метилирование гидроксила при С5 (авермектины А). Компоненты, не содержащие СН3 - Радикала при С5, Относятся к авермектинам В. Активность метилирования снижается в ряду: В2а Агликон > В2а Моносахарид > В1а Агликон > В1а Моносахарид > В2а > В1а. Компонент В1а Практически не метилируется. Компоненты 2 Метилируют­ся быстрее, чем компоненты 1, а компоненты B - Быстрее, чем компоненты А.

Другой биохимической особенностью трансформации компонентов комплекса является закономерность, согласно которой компоненты А Дегидратируются в пози­ции С22-23 С эффективностью 50 %, а компоненты B С эффективностью 67 %. Таким образом, компоненты А Превращаются в авермектины 1 И 2 В соотношении 1 : 1, а компоненты B - В соотношении 2 : 1.

Из всех восьми компонентов комплекса авермектины фракции В1 Обладают наибольшей антипаразитарной активностью. Выделенный в чистом виде авермектин В 1 Получил название абамектин. На его основе и на основе его дигидропроизводно-го - ивермектина, фирмой Merck, Sharp & Dohme разработан ряд препаратов как ве­теринарного назначения, так и для защиты растений. В России фирмой «Фармбио-мед» разработан ряд препаратов для ветеринарии и растениеводства, действующим началом которых является природный авермектиновый комплекс, названный аверсек-тином С [2]. Ввиду сложности разделения компонентов В1а и В1b Ветеринарные препа­раты содержат оба компонента, однако доля авермектина В1 А В них составляет 80 %. Путем многочисленных исследований было выяснено, что экономичность процедуры очистки и получения препаратов с высоким содержанием авермектина В 1 А Во многом зависит от компонентного состава комплекса, образуемого в процессе ферментации.

Физиолого-биохимические условия образования авермектинов

Причиной изменений композиции авермектинового комплекса являются, по мнению В. А. Миронова и соавторов, изменения в углеводном обмене актиномицета, которые, в свою очередь, определяются доступностью источника углерода. Сниже­ние углерода в среде лимитирует метаболизм клетки по углероду скорее не прямо, а косвенно, так как уменьшает соотношение углерода и азота, вызывая повышение включения углерода в азотсодержащие соединения, а не в безазотистые метаболиты, какими являются, например, авермектины. Поэтому изучение условий ферментации, определяющих повышенное содержание авермектинов В1 И, прежде всего, компо­нента В1 А В комплексе, представляет значительный практический интерес.

Ввиду выгодности использования препарата с преобладанием компонента В1 Проводились опыты со штаммом S. Avermitilis На средах с глюкозой в различных кон­центрациях. Было отмечено, что увеличение концентрации углевода ведет к следую­щим изменениям в комплексе: повышаются доли компонентов В И 1, но снижается доля компонентов А. Увеличение доли компонентов В Сопровождалось снижением степени метилирования всех четырех компонентов фракции В (В1а, В1 b, В2а, В2 b). В соответствии с данными литературы степень метилирования компонентов В Уменьшается в ряду: В1а > В1b > В2а > В2b. В увеличении доли компонентов 1 Основ­ной вклад вносит повышение доли компонентов 1b. При этом наблюдается снижение доли компонентов А И В По фракциям компонентов 1 И 2. Компоненты А Распределя­ются по фракциям 1 И 2 Поровну, а компоненты B - В соотношении близком 2 : 1, со­ответственно. В то же время недостаток углевода в среде ведет к повышению доли

59


Компонентов А В комплексе. Что касается такого параметра в композиции комплекса как степень распределения компонентов А Во фракции 1 И 2, то изменения его воз­можны только посредством генетических методов, поэтому исследования последних лет сосредоточены на решении этой практически важной проблемы. К настоящему времени геном S. Avermitilis Охарактеризован почти полностью, что позволяет решать задачу создания авермектиновых препаратов с заданной композицией методами ген­ной инженерии и протеомики [2].

В связи с недостаточной изученностью авермектинов существуют проблемы в регуляции их биосинтеза, подборе сред и индукторов для их получения. Все эти во­просы были детально проработаны Т. В. Петрук и соавторами [4]. Объектом иссле­дования для проверки авермектинсинтезирующей активности был вариант S. Aver­Mitilis УКМ Ас 2161 № 288. Этот вариант отобран путем предварительных исследо­ваний, проводимых в отделе общей и почвенной микробиологии Института микро­биологии и вирусологии НАН Украины. Исследуемый в дальнейшем вариант выде­лен из черноземной почвы Попильнянского района Житомирской области.

Для сохранения культуры и накопления спорового материала авторами исполь­зовалась среда ISP-3 такого состава (г/л): овсяные хлопья - 20,0; солевой раствор (FeSO4.7H2O - 0,1; MnCl2 4H2О - 0,1; ZnSO47H2O - 0,1) - 1 мл/л; агар-агар (Difco) -15,0; рН 7,2. Культуру инкубировали при температуре +28°С на протяжении 14 суток.

Для определения активности при поверхностном культивировании варианты выращивали при температуре +28°С на протяжении 10 суток на модифицированном картофельно-глюкозном агаре (КГА) (г/л): отвар 200 г очищенного картофеля; (NH4)2SO4 - 0,15; СаСО3 - 3,0; глюкоза - 20,0; агар-агар (Difco) - 15,0; РН 7,2. При глубинном культивировании маточную культуру выращивали на протяжении суток на среде следующего состава (г/л): соевая мука - 15,0; сухие дрожжи - 5,0; глюкоза -20,0; РН 6,2. Процесс ферментации проводили в такой среде (г/л): соевая мука - 16,0; сухие дрожжи - 4,0; растворимый крахмал - 23,0; СаСО3 - 4,0; К2НРО4 - 1,0; глюкоза -60,0 %; РН 6,2. К 50 мл ферментационной среды добавляли 2 % маточной культуры, выращивали на качалках при 240 об./мин в колбах объемом 500 мл. Авермектинсинте-зирующую активность проверяли на 7-е сутки. Кроме того путем индуцированного мутагенеза нитрозогуанидином (НГ) удалось повысить биосинтетическую активность в 6,0-6,4 раза. Непосредственно перед экспериментом НГ растворяли в 0,1 М цитрат-ном буфере (рН 5,5). Конечная концентрация НГ в мутагенной смеси составила 2 мг/мл. Споровую суспензию актиномицета готовили путем смывания спор с поверх­ности газона на среде ISP-3 раствором 20 %-го глицерина в воде. Полученная таким образом суспензия считалась рабочей. Титр спор в суспензии равен 1,8∗108 КОЕ/мл.

После обработки спор мутагеном отбор вариантов для их последующей про­верки на авермектинсинтезирующую активность осуществляли при уровнях выжи­вания 0,10-0,01 % (экспозиция 90 мин). Известно, что именно в этих условиях наи­большая вероятность получения вариантов актиномицетов с повышенной биосинте­тической активностью. Биосинтетическую активность оценивали по количеству авермектинов (мкг) в 1 см3 этанольного экстракта из мицелия стрептомицета. Для выделения авермектинов из мицелия 10 мл КЖ центрифугировали на протяже­нии 20 минут при 4000 об./минуту. К осадку добавляли 10 мл охлажденной дистил­лированной воды, перемешивали и центрифугировали 10 минут при 4000 об./минуту. Отмывание проводили 3-4 раза. К осадку добавляли 5 мл этанола и при постоянном перемешивании осуществляли экстракцию авермектинов при комнатной температуре 30 минут. Центрифугировали 10 минут при 4000 об./минуту. Качественный состав авермектинов определяли методом тонкослойной хромотографии в системе гексан - ацетон - этанол; в качестве контроля использовали стандартный раствор авермекти­нов «Аверсектин С» [4].

60


Методы определения авермектинов

Актуальной проблемой в связи с необходимостью организации промышленно­го производства авермектинов и соответствующим контролем за процессом фермен­тации, а также с первичным скринингом культуры продуцента является разработка простого и высокоточного метода определения авермектинов, так как описанные в литературе методы тонкослойной и высокоэффективной хроматографии малопри­годны для этих целей [5].

В. А. Мосиным и соавторами [3] разработан колориметрический метод опреде­ления авермектинов, основанный на измерении оптической плотности продукта взаимодействия авермектинов с орцином в органической фазе при λ 630-640 нм. Этот метод применим для определения авермектинов в экстрактах культуральной жидкости Streptomyces Avermitilis И в кристаллических препаратах. Относительная погрешность данного метода составляет 4-8 %. В качестве стандарта в работе ис­пользовали препарат авермектина производства фирмы Merck (США). В состав авермектинов входит дидезоксисахар, представленный дисахаридом L-олеандрозой. Описано много цветных реакций на дезоксисахара, однако все реакции адаптированы для проведения анализа в водной фазе. Так как авермектины отличаются малой рас­творимостью в воде, для их экстракции из мицелия применяют органические раство­рители, смешивающиеся с водой: ацетон, метанол и этанол. Поэтому с целью разра­ботки колориметрического метода определения авермектинов необходимо осущест­вить выбор химической реакции на углеводный компонент, дающий цветной ком­плекс с авермектинами; подбор органической фазы для проведения цветной реакции; подбор оптимальных условий проведения цветной реакции.

В результате проведенных исследований установлено, что оптимальной орга­нической фазой для проведения реакции Биаля с авермектинами является Н-бутанол, а оптимальными условиями - нагревание в течение 15-20 минут при +75…+80°С. Реакция оказалась очень чувствительной к низким концентрациям авермектинов, что позволяет определять их содержание до 1 мкг/мл. Проведенные исследования пока­зывают, что метод определения содержания авермектинов включает в себя следую­щие этапы: получение влажного осадка мицелия путем цетрифугирования при 3000 об./минуту в течение 20 минут; промывание осадка мицелия дистиллированной водой при +7…+10°С в количестве, соответствующем количеству культуральной жидкости, взятой для анализа, в течение 5 минут; осаждение промытого мицелия центрифугированием при 3000 об./минуту в течение 10 минут; получение этанольно-го или ацетатного экстрактов авермектинов при комнатной температуре в течение 20 минут при постоянном перемешивании; разведение экстрактов до концентрации авермектинов 2-20 мкг/мл в 2-50 %-ном этаноле или 0,2-2 %-ных ацетоне или Н-бутаноле; проведение цветной реакции в пробирках, содержащих по 2 мл стан­дартного раствора авермектинов, 2 мл орцинового реактива и 1 мл Н-бутанола. Про­бы тщательно перемешивали. Одновременно готовили контрольный раствор, где вме­сто авермектинов использовали Н-бутанол. Пробирки помещали на водяную баню (+75… +80°С) и выдерживали 15-20 минут. После инкубации при указанных условиях, определяли величину оптической плотности на ФЭК 56-М. Содержание авермектинов оценивали по величине оптической плотности с помощью калибровочного графика.

Данный метод пригоден для использования в отношении кристаллических препаратов и культуральной жидкости. Преимуществом этого метода перед извест­ными является низкая себестоимость проведения анализа образцов. Это представля­ется особенно ценным при оперативном контроле процесса промышленной фермен­тации, направленной селекции продуцентов и т. д. Предлагаемый метод испытан на ряде заводов при наработке опытных партий антипаразитарных препаратов на основе авермектинов [3].

61


Методы выделения авермектинов

На сегодняшний день в патентной и научной литературе описан ряд способов извлечения авермектинов из биомассы с использованием органических растворите-лей, как смешивающихся (низшие спирты, ацетон), так и не смешивающихся с водой (хлористый метилен, хлороформ). Большинство описанных способов касаются из-влечения авермектинового комплекса либо из цельной культуральной жидкости про-дуцентов, либо из отфильтрованной сырой биомассы. Кроме того, был предложен способ выделения авермектинового комплекса из высушенной мицелиальной био-массы продуцента Streptomyces Avermitilis. В опытах по экстракции использовали этиловый, изопропиловый спирты и ацетон.

При сравнении компонентного состава авермектиновых комплексов, извлечен-ных из биомассы этиловым, изопропиловым спиртами и ацетоном, между ними не было обнаружено каких-либо существенных различий. Все они содержали высокий процент авермектина В И соответствующее этанолу количество авермектинов А, А2а И В2а. Однако анализ экстрактов свидетельствует о том, что степень извлечения авермектинового комплекса и удельная активность экстрактов, полученных с помо-щью этилового спирта, были заметно выше, чем при использовании изопропилового спирта или ацетона. При исследовании сравниваемых экстрактов методом тонко-слойной хроматографии отмечено, что в экстрактах, полученных при использовании изопропилового спирта и ацетона, содержится большее количество липофильных примесей, чем в экстракте, полученном с помощью этилового спирта. Сопоставление удельной активности авермектинового комплекса в экстрактах с активностью сухой биомассы показало, что степень чистоты в этанольном экстракте повысилась в 6 раз, в изопропиловом спирте – в 4,5 раза, а в ацетоновом экстракте в 3,5 раза. Таким обра-зом, предпочтительным оказалось использование 96 %-ного этилового спирта. По сравнению с исходной биомассой экстракция этиловым спиртом обеспечивает повышение чистоты авермектинового комплекса в 6 раз. Состав авермектинового комплекса полностью соответствовал составу описанного ранее авермектина С.

В процессе работы обнаружена нестандартность сырья по показателю экстраги-руемости из него авермектинового комплекса: степень извлечения действующего ве-щества варьировала от 36 до 70 %. Так, проведение повторной экстракции с одновре-менным продлением времени экстракции до 1,5 ч позволило в производственных ус-ловиях достичь практически 100 %-ного извлечения авермектинового комплекса. Наи-более высокий процент выхода авермектинового комплекса обеспечивается при ис-пользовании 75 %-ного этилового спирта. Однако при этом ухудшается качество экс-тракта по показателям удельной активности и цветности, что усложняет дальнейшую очистку авермектинового комплекса. Следует отметить, что при повторной экстракции 75 %-ным спиртом можно добиться практически полного выхода авермектинового комплекса даже для низкоактивных партий. Однако, в противоположность высокоак-тивным партиям, чья удельная активность при повторной экстракции несколько повы-силась, для «низкоактивных» партий наблюдалось снижение активности, что свиде-тельствует о наличии в препарате авермектинового комплекса посторонних примесей.

Заключение

Авермектины стрептомицетов – достаточно разнородная как по структуре, так и по функциям группа биологически активных веществ. Они являются эффективны-ми средствами борьбы с эндо - и эктопаразитами животных и вредителями растений, а также представляют интерес в связи с их противоопухолевым действием. Дальней-шее изучение авермектинов является перспективным и дает возможность более де-тально изучать потенциальные возможности различных продуцентов стрептомицет-ной природы в плане их биосинтеза.

62


Библиографические ссылки

1. Давыдова Е. М. Изучение условий экстракции авермектинового комплекса из высушен-ной мицелиальной биомассы Streptomyces Avermetilis / Е. М. Давыдова, Е. Б. Кругляк // Біотехнологія. – 2000. – № 6. – С. 66–74.

2. Миронов В. А. Зависимость состава авермектинового комплекса Streptomyces Avermitilis От содержания глюкозы в среде / В. А. Миронов, А. В. Сергеева // Прикл. биохим. и мик-робиол. – 2003. – № 2. – С. 208–212.

3. Мосин В. А. Авермектины: колориметрический метод определения в культуральной жид-кости Streptomyces Avermitilis И кристаллических препаратах / В. А. Мосин, В. А. Дриняев // Биотехнология. – 2004. – № 1. – С. 9–12.

4. Петрук Т. В. Підвищення біосинтезу авермектинів Streptomyces Avermitilis УКМ Ас 2161 під впливом N-метил-N-нітро-N-нітрозогуанідину / Т. В. Петрук, Л. О. Белявская // Мікробіол. журн. – 2004. – № 6. – С. 24–29.

5. Черменский Д. Н. Авермектины: биотехнологичекие особенности штамма продуцента Streptomyces Avermitilis ВКМ Ас 1301 / Д. Н. Черменский, В. А. Аданин // Прикл. биохим. и микробиол. – 1991. – № 6. – С. 838–844.

Надійшла До Редколегії 04.01.06.

Похожие статьи