Головна Біологія Біологія тварин НА ЇЇ ЗБЕРЕЖЕННЯ
joomla
НА ЇЇ ЗБЕРЕЖЕННЯ
Біологія - Біологія тварин
<

С. Б. Корнят

Інститут біології тварин УААН, м. Львів

Наведено дані про вплив метіоніну і цистину, введених у різних кількостях до середовища Для розбавлення і зберігання сперми кнурів, на активність сперміїв протягом 4 днів зберігання, Реакцію середовища та його осмотичний тиск. Показано, що введення в середовище для Розбавлення і зберігання сперми кнурів метіоніну і цистину покращує його дію на збереження активності сперміїв протягом короткотривалого (до 3 днів) зберігання сперми кнурів та на 8,74 Та 3,61 % підвищує збереження сперміїв після їхнього трьохденного зберігання. Введення в середовище для розбавлення і зберігання сперми кнурів цистину і метіоніну підвищувало на 3,45 Та 5,26 % відповідно запліднюваність свиноматок.

Ключові слова: СПЕРМА, СПЕРМІЇ, КНУР, ЦИСТИН, МЕТІОНІН, АКТИВНІСТЬ.

Розбавлення сперми кнурів, яка в подальшому використовується для штучного осіменіння свиноматок, дозволяє не тільки збільшити об’єм еякуляту, що має значення при осіменінні кількох самок одним еякулятом, а й створити захисне середовища для сперміїв поза організмом самців, фізико-хімічні і біологічні властивості якого сприяли б подовженню життя сперміїв, порівняно до нативного еякуляту та максимального збереження їх запліднюючої здатності. Проте взяття, розбавлення, транспортування і зберігання розбавленої сперми кнурів пов’язані з охолодженням сперміїв, порівняно з температурою, в якій вони перебували до еяколяції, до 20 °С за досить короткий час [1]. Розбавлена сперма кнурів зберігається в охолодженому стані, що сповільнює метаболічні процеси в сперміях і їх капацитацію та сприяє тривалому збереженню цілісності акросоми сперміїв [2]. Зміни, які відбуваються в інкубованих сперміях кнура при набуванні ними стійкості до холодового шоку, остаточно не з’ясовані. Холодовий шок сперміїв пов’язують iз змінами у ліпідному складі мембрани сперміїв [3]. Внаслідок різних температур топлення окремих ліпідних компонентів мембран сперміїв, частини мембрани можуть при охолодженні роз’єднуватися, що, в свою чергу, може призводити до руйнування білків мембран, що змінює їх структуру і проникність каналів [4, 5].

Набування сперміями стійкості до холодового шоку після інкубації при кімнатній температурі ряд дослідників пояснюють адсорбцією білків плазми сперми сперміями [6]. Внаслідок адсорбції білків зростає співвідношення білків до ліпідів у плазматичній мембрані сперміїв кнура і підвищується їх стійкість при охолодженні. Інший підхід для забезпечення підвищення співвідношення білків до ліпідів у плазматичних мембранах сперміїв кнурів полягає у включенні в склад синтетичних середовищ для розбавлення сперми білків або амінокислот, які були б здатні утворювати комплекси з компонентами мембрани сперміїв. Цим умовам відповідають сірковмісні амінокислоти, зокрема цистин, який відіграє важливу роль у стабілізації просторової форми білкової молекули внаслідок зв’язування її дисульфідними зв’язками [7]. Тому важливе місце серед сполук білкової природи, які додаються в середовища для розбавлення і зберігання сперми кнурів, займають сірковмісні амінокислоти та білки з високим вмістом цих амінокислот або амінокислоти, які містять сульфгідрильні групи, котрі стабілізують мембрану сперміїв при зберіганні і охолодженні та попереджують її капацитацію [8].

Встановлена позитивна залежність між вмістом вільних тіолів (сульфгідрильних груп) у спермі та цілісності ДНК у сперміях. Протягом сперміогенезу ущільнення ядер сперматид здійснюється завдяки послідовній заміні гістонів перехідними білками, а в кінці — багатими на вміст цистеїну протамінами. Поступове окиснення протамін-вільних сульфгідрильних чи тіолових (SH) груп до дисульфідів в епідідімусі далі посилює ущільнення ДНК сперми [9]. Неповне окиснення сульфгідрильних груп протаміну сперми при проходженні сперми через епідідімус призводить до підвищення чутливості ДНК сперми, до пошкоджень. Цілісність ДНК корелює з рівнем вільних сульфгідрильних груп в епідімальних сперматозоїдах самців багатьох видів тварин [10].

Крім того, рядом дослідників було встановлено негативну кореляцію між вмістом сульфгідрильних груп у спермі і рухливістю сперміїв при значному зростанні їхньої кількості [11]. Загальна кількість тіолів і дисульфідів сперми самців ссавців залишається сталою протягом всього періоду дозрівання сперми, але відношення вільних тіолів до загальних суттєво зменшується від тіла до хвостової частини епідідімусу [12]. Поступове окиснення тіолів сперми до дисульфідів сприяє ущільненню хроматину у сперміях і стабілізацію структури хвостової частини сперміїв та їх руху [13]. Сульфгідрильні складники сперми кнурів, такі як глютатіон і ерготіонеїн відіграють важливу роль у захисті сперміїв кнурів від окисних пошкоджень [14]. Проте вплив цистеїну і метіоніну, доданих у середовище для зберігання сперми кнурів, на активність сперміїв при зберіганні сперми поза організмом з’ясовано недостатньо. Виходячи з цього, метою цієї роботи було дослідження впливу сірковмісних амінокислот цистину і метіоніну, при додаванні їх до середовища для розбавлення сперми кнурів у різних кількостях, на активність сперміїв протягом зберігання.

Матеріали і методи

Дослідження проведені на базі ТзОВ ЛНВЦ «Західплемресурси» та в умовах лабораторії біології та патології відтворення тварин Інституту біології тварин УААН. Об´єктом досліджень служила сперма кнурів-плідників порід ландрас, велика біла і дюрок віком 1–2 роки. Кнурі утримувалися безвигульно в окремих клітках з глухими перегородками. Годівля тварин відповідала прийнятим нормам [15]. Сперма від кожного кнура відбиралася 7–9 разів на місяць. Еякуляти у кнурів відбиралися до ранкової годівлі мануально після садки на дерев’яне опудало, розроблене в Інституті свинарства ім. О. В. Квасницького УААН. Після зважування еякулятів та вимірювання концентрації сперміїв у них проводилося їхнє розбавлення у лабораторії середовищем «Екосперм» з додаванням сірковмісних амінокислот метіоніну і цистину. За контроль правило середовище для розбавлення і зберігання сперми «Екосперм» без добавки амінокислот. Метіонін і цистин додавали в середовище в кількості 100, 200 або 300 мг.

Дослідження впливу амінокислот на якість сперми проводилося щоденно шляхом визначення активності сперміїв, рН та осмотичного тиску в розбавленій спермі протягом зберігання. рН середовища визначали на рН-метрі 340, осмотичний тиск вимірювали осмометром ОМКА ІЦ-01. Концентрація сперміїв в еякулятах визначалася на станції штучного осіменіння свиней на спектрофотометрі SDM-5, а активність розбавленої та нативної сперми — на мікроскопі MBL-2000 та в лабораторії на мікроскопі Биолам П-1 і підігрівальному столику СН-02. Розбавлена сперма зберігалася при температурі +17–18 0С без доступу денного світла. Зразки сперми перед обстеженням старанно вимішувалися для кращого контакту сперміїв з середовищем.

Результати й обговорення

У таблиці 1 наведено дані про вплив метіоніну, доданого до середовища для розбавлення і зберігання сперми кнурів «Екосперм», на активність сперміїв протягом

Зберігання, рН, осмотичний тиск у середовищі. З наведених у таблиці даних видно, що в день взяття після розбавлення сперми дослідних кнурів в усіх досліджуваних варіантах середовищ активність сперміїв була вищою на 1,5-4,6 % Ніж у контролі. У наступні дні після розбавлення (1-4-й) активність сперміїв у першому досліді була відповідно на 3,8, 4, 8,7 і 6,7 % вищою, ніж у контрольному варіанті середовища і на третій день зберігання ця різниця була статистично достовірною.

Таблиця 1

Вплив різних доз метіоніну, доданих до середовища «Екосперм», на збереження активності сперміїв

При розбавленні сперми кнурів (М±м, n=3)

День зберігання

Досліджувані показники

Варіанти досліду

К

1

2

3

0

Активність

81,25 ± 1,25

85,0 ± 2,24

83,0 ± 1,22

82,5 ± 1,44

Осм. тиск

301 ± 3,18

303 ± 14,91

309 ± 7,15

312 ± 9,11

РН

6,95 ± 0,08

7,01 ± 0,03

6,97 ± 0,03

6,95 ± 0,05

1

Активність

78,75 ± 1,25

81,74 ± 1,87

79,0 ± 1,0

78,75 ± 1,25

Осм. тиск

309 ± 12,24

311 ± 22,8

318 ± 15,89

319 ± 25,74

РН

6,99 ± 0,09

7,09 ± 0,05

6,92 ± 0,14

7,01 ± 0,07

2

Активність

75 ± 2,04

78,0 ± 1,22

76,0 ± 1,87

75,0 ± 2,04

Осм. тиск

319 ± 1,85

323,6 ± 1,78

326,6 ± 1,43

322,33 ± 0,33

РН

6,92 ± 0,08

6,99 ± 0,05

6,97 ± 0,07

6,95 ± 0,03

3

Активність

67,5 ± 1,04

73,4 ± 1,83*

70,0 ± 2,24

67,5 ± 3,23

Осм. тиск

298 ± 1,22

297,7 ± 6,41

294 ± 8,48

312,75 ± 7,46

РН

6,92 ± 0,07

6,97 ± 0,10

6,91 ± 0,17

6,81 ± 0,13

4

Активність

63,75 ± 2,39

68,0 ± 1,58

64,0 ± 1,87

58,75 ± 1,21

Осм. тиск

299,25 ± 9,0

287,4 ± 12,46

256,2 ± 11,59*

242,75 ± 8,46*

РН

6,84 ± 0,07

6,92 ± 0,07

7,01 ± 0,04

6,84 ± 0,09

Примітка: У цій та наступних таблицях * - статистично достовірні різниці в досліджуваних показниках у дослідних зразках сперми порівняно до контрольної: * - Р < 0,05, ** - Р < 0,01, *** - Р < 0,001.

Осмотичний тиск у дослідних зразках сперми мало відрізнявся від контрольних зразків протягом чотирьох днів зберігання так само, як і реакція середовища, проте закислення середовища в дослідних зразках відбувалося дещо повільніше.

У другому досліді активність сперміїв у дослідних зразках сперми протягом 1-4-го дня зберігання була на 0,3, 1,3, 3,7 і 7,9 % вищою, ніж у контролі, проте ці різниці були статистично недостовірними (Р ≤ 0,5). Реакція середовища у дослідному і контрольних зразках не мала значних різниць так само, як і осмотичний тиск (Р ≤ 0,05). Проте на четвертий день зберігання осмотичний тиск у дослідному зразку був на 14,4 % Меншим, порівняно з контролем і ця різниця була статистично достовірною (Р < 0,05). У третьому досліді активність сперміїв у дослідних зразках сперми була приблизно однаковою з контролем, але на четвертий день зберігання вона була на 7,9 % меншою. Зміни в реакції середовища та осмотичному тиску були аналогічними до другого досліду і на четвертий день зменшення осмотичного тиску в дослідному зразку становило 18,9 % порівняно з контролем і ця різниця була статистично достовірною (Р < 0,05).

У таблиці 2 наведено дані про вплив різних доз цистину, при додаванні його до середовища «Екосперм», на активність сперми протягом 4 днів зберігання, її осмотичний тиск та реакцію. З наведених даних видно, що дещо краще, порівняно з контролем, вплинув на активність сперміїв тільки перший варіант дослідного розбавника. Так, активність сперміїв у 1-му дослідному варіанті протягом 1-4-го дня зберігання була відповідно на 3,1, 2,1, 3,6 і 2,7 % більша, ніж у контролі, проте ці різниці статистично недостовірні (Р ≤ 0,5). У другому і третьому варіантах активність сперми, порівняно з контролем, була нижчою, що можна пояснити негативним впливом високих концентрацій сірки в середовищі для

Розбавлення і зберігання сперми кнурів на життєздатність сперміїв, що узгоджується з даними інших авторів.

Таблиця 2

Вплив різних доз цистину, доданих до середовища «Екосперм», на збереження активності сперміїв

При розбавленні сперми кнурів (М±м, n=3)

День зберігання

Досліджувані показники

Варіанти досліду

К

1

2

3

0

Активність

70 ± 2,31

71,8 ± 2,24

68,18 ± 2,17

67,5 ± 0,94

Осм. тиск

301 ± 3,58

309 ± 2,61

311 ± 8,65

314 ± 4,51*

РН

6,82 ± 0,02

6,92 ± 0,03

6,95 ± 0,03*

6,99 ± 0,02**

1

Активність

65,0 ± 5,74

67,0 ± 5,58

62,73 ± 2,89

61,25 ± 0,82

Осм. тиск

333,62 ± 3,35

329,5 ± 2,82

328,5 ± 3,94

329,75 ± 3,54

РН

6,87 ± 0,05

7,01 ± 0,08

6,86 ± 0,09

6,82 ± 0,06

2

Активність

64,12 ± 3,77

65,5 ± 3,11

62,27 ± 4,83

61,25 ± 3,51

Осм. тиск

333,75 ± 3,96

326,62 ± 1,99

323,5 ± 1,41

328,75 ± 1,21

РН

7,1 ± 0,07

7,03 ± 0,06

7,31 ± 0,16

7,18 ± 0,09

3

Активність

62,25 ± 4,21

64,5 ± 3,83

61,91 ± 4,83

60,87 ± 5,08

Осм. тиск

334,25 ± 1,05

333,87 ± 0,64

331,87 ± 0,79

332,62 ± 0,99

РН

7,02 ± 0,06

7,09 ± 0,11

6,97 ± 0,10

6,99 ± 0,11

4

Активність

60,2 ± 3,59

61,8 ± 4,65

60,1 ± 3,48

60,37 ± 4,17

Осм. тиск

327,25 ± 1,32

328,5 ± 2,19

327,25 ± 2,27

327,37 ± 0,78

РН

7,12 ± 0,09

7,08 ± 0,03

7,14 ± 0,11

7,06 ± 0,06

У третьому досліді після розбавлення сперми у середовищі осмотичний тиск розбавленої сперми був достовірно більшим, ніж у контрольному середовищі. У другому і третьому дослідах у день розбавлення середовище було достовірно менш кислим. Протягом зберігання осмотичний тиск і реакція середовища у дослідних зразках сперми незначно відрізнялися від контролю.

Таблиця 3

Амінокислота, яка додавалася в розбавник

Групи тварин

Осіменено тварин, голів

Запліднилось тварин

Голів

%

Метіонін

К

25

19

76

Д

25

20

80

Цистин

К

42

29

69

Д

42

30

71,4

У результаті досліджень з’ясовано позитивний вплив додавання цистину та метіоніну до середовища для зберігання сперми кнурів «Екосперм». Так, активність сперміїв у кращих дослідних варіантах середовища була на третій день зберігання на 3,61-8,74 % Вищою ніж у контрольних варіантах Реакція середовища протягом зберігання і його осмотичний тиск мало відрізнялися між дослідним і контрольним зразками. Після цього було проведено порівняльне осіменіння свиноматок спермою, яка зберігалася у середовищі «Екосперм», і спермою з дослідними варіантами середовища, до якої додавали вказані сірковмісні сполуки в кількостях, які показали найкращі результати при зберіганні сперми кнурів в умовах лабораторії. Результати осіменіння свиноматок наведені в таблиці 3. З отриманих результатів видно, що при застосуванні всіх дослідних зразків середовищ з спермою, заплідненість свиноматок після осіменіння була вищою, проте різниці незначні.

У таблиці 4 наведені дані про ефективність застосування дослідних варіантів розбавника сперми кнурів порівняно з контролем. Результати при застосуванні контрольного розбавника («Екосперм»), взято за 100 % а результати, отримані в дослідних варіантах, виражено у відсотках до контролю. Встановлено, що найбільшу активність мала сперма, при розбавленні її середовищем з додаванням метіоніну, далі йде середовище з додаванням

Цистину. На третій день зберігання сперми в обох дослідних варіантах активність сперміїв була вищою, порівняно з контролем. При аналізі результативності осіменіння видно, що у двох дослідних групах цей показник був вищим порівняно з контролем, хоч різниці і незначні. Цистин показав кращий результат, ніж метіонін.

Таблиця 4

Показники ефективності застосування дослідних розбавників сперми кнурів Порівняно з контрольним у %

Розбавник

Активність сперми на 1-й день зберігання

Активність сперми на 3-й день зберігання

Запліднюваність свиноматок, %

Екосперм

100

100

100

Е + цистин

103,1

103,61

105,26

Е + метіонін

103,8

108,74

103,45

Отже, застосування дослідних варіантів розбавників на 3,5–5,3 % підвищує запліднюваність свиноматок порівнювано з контрольним середовищем та на 3,61–8,74 % підвищує збереженість сперми після трьохденного зберігання. Додавання метіоніну і цистину до середовища для розбавлення і зберігання сперми кнурів «Екосперм» має позитивний вплив на активність збереженої сперми та підвищує результативність штучного осіменіння свиноматок, внаслідок їхньої дії на стабілізацію мембран сперміїв при розбавленні і зберіганні, що може бути використано при удосконаленні цього розбавника сперми кнурів.

Висновки

Введення у середовище для розбавлення і зберігання сперми «Екосперм» цистину і метіоніну підвищує збереження активності сперміїв протягом короткотривалого (до 3 днів) зберігання сперми кнурів та відповідно на 3,61 та 8,74 % підвищує збереження сперміїв після їхнього трьохденного зберігання порівняно з контролем.

Введення у середовище для розбавлення і зберігання сперми кнурів цистину і метіоніну підвищує на 3,45 та 5,26 % відповідно запліднюваність свиноматок.

Перспективи подальших досліджень. У подальшому планується продовження досліджень впливу введення в середовище для розбавлення та зберігання сперми кнурів цистину і метіоніну в поєднанні з іншими органічними сполуками, які б підсилювали їх спермозберігаючу дію у середовищі.

С. Б. Корнят